طراحی و ساخت پلاسمید حاوی مبداء همانندسازی میتوکندری و ارزیابی تکثیر آن در رده ی سلولی انسان

زمینه و هدف: هدف از این پژوهش ساخت پلاسمید با مبداء همانندسازی ژنوم میتوکندری انسان به منظور دستیابی به ناقلی ایمن است که قادر باشد به صورت اپی زومال و به وسیله عناصر ترانس سلول انسان شناسایی و همانندسازی شود. مزیت این ناقل نسبت به ناقلین آدنو ویروسی ماندگاری و نسبت به ناقلین رترو ولنتی ویروس عدم ورود در ژنوم سلول میزبان می باشد. روش تحقیق: سه قطعه شامل مبداء های همانندسازی رشته ی سبک و سنگین ژنوم میتوکندری و ژن gfp با روش PCR تکثیر و در وکتور pTZ57T/A کلون شدند. قطعه ژن hygro از پلاسمید pFBGGT با هضم آنزیمی جداسازی شد. سپس هر چهار قطعه در پلاسمید pBGGT ساب کلون گردیدند. تمام کلون های بینابینی و پلاسمید نهایی با روش PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی بررسی شدند. سلول های HEK293 و CHO با سازه نهایی ترانسفکت شدند. سلول های ترانسفکت شده با میکروسکوپ فلورسنت به مدت چهل روز به صورت روزانه مشاهده شدند. از سلول های باقی مانده، پلاسمید و DNA ژنومیک تخلیص گردید و بر روی آن ها PCR های همپوشان به منظور اثبات حلقوی بودن پلاسمید انجام شد. یافته ها: نتایج حاصل از PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی همگی تأیید کننده ی صحت انجام ساخت سازه بود. نتایج حاصل از ترانسفکشن سلول های HEK293 و CHO نشانگر عدم همانندسازی پلاسمید در سلول های فوق بود. نتیجه گیری: با توجه به این که پلاسمید واجد دو مبداء همانندسازی میتوکندری نتوانست درون سلول های انسانی تکثیر شود، به نظر می رسد مجبور به فراهم آوری شرایط مشابه همانندسازی ژنوم میتوکندری به منظور همانندسازی ناقل نامبرده در تحقیقات آتی باشیم.